前言

結核病(tuberculosis，TB)是一種嚴重危害人類(lèi)健康的慢性傳染病，目前全球有約20億人被感染，每年新出現結核病患者約800萬(wàn)～1000萬(wàn)，每年因結核病死亡人數約為200萬(wàn)～300萬(wàn)。TB是由結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的呼吸道傳染性疾病，可累及全身多器官系統，最常見(jiàn)的患病部位是肺臟，占各器官TB總數的80%~90%，也可以累及肝、腎、腦、淋巴結等器官。MTB主要通過(guò)呼吸道傳播?；顒?dòng)期肺結核患者的痰液干燥后，細菌隨塵土飛揚，被他人吸入也可引起感染，人體吸入含有MTB的飛沫是否患病主要由吸入結核菌的數量、毒力、人體的抵抗力等多種因素有關(guān)。

TB動(dòng)物模型的制備和應用可以獲得TB發(fā)生和發(fā)展中的一些特性，如TB感染后引起的免疫應答以及對病原的相關(guān)研究。此外，標準化的動(dòng)物模型還可應用于新研制疫苗的評價(jià)以及觀(guān)察新藥物對TB的治療效果。根據動(dòng)物模型來(lái)源和應用范圍，MTB動(dòng)物模型可分為潛伏感染動(dòng)物模型和急性感染動(dòng)物模型兩大類(lèi)。

部分造模方法

使用動(dòng)物：小鼠、大鼠、豚鼠

【造模機制】：

MTB感染可引起活動(dòng)性TB及潛伏感染等。選擇不同品系的動(dòng)物、結核菌量的多少以及不同感染途徑都可引起模型的差異。使用高劑量的強毒株對敏感動(dòng)物進(jìn)行攻毒，一般可建立結核病的急性感染模型。小鼠因其對MTB高度敏感：遺傳背景清晰、檢測試劑容易獲得、成本相對較低且具備比較成熟的基因定向敲除技術(shù)等特點(diǎn)，成為最常用的MTB感染的動(dòng)物模型。不同品系動(dòng)物遺傳特性的差異，小鼠對MTB的敏感性也不相同，NIH小鼠和BALB/c小鼠對MTB不敏感；615和TA1小鼠的性別差異大；ICR、TA2和DBA/2小鼠雖然對MTB較敏感，但每克臟器含菌最顯著(zhù)低于C57BL/6和昆明鼠。C57BL/6小鼠對MTB感染最敏感，較為常用。

【造模方法】：

小鼠：不同品系小鼠由于其遺傳特性的不同，其對結核分枝桿菌H37Rv株敏感性也不同。如BALB/c和C57BL/6小鼠對H37Rv敏感性是DBA/2和C3H/HeJ小鼠的2倍，目前常用BALB/c和C57BL/6小鼠復制MTB感染模型。小鼠尾靜脈接種1×106CFU H37Rv標準毒株，2周后即可出現體重下降，狀態(tài)萎靡，剖檢發(fā)現肺部有明顯的肉芽腫形成（圖6-1A/文末彩圖6-1A)，H&E染色后發(fā)現肉芽腫組織由大量上皮細胞和淋巴細胞組成，部分肺組織壞死，紅細胞滲出明顯，大量淋巴細胞和泡沫細胞聚集在支氣管及血管周?chē)▓D6-1B/文末彩圖6-1B)。小鼠脾、肺臟器研磨進(jìn)行CFU計數能獲得較高的荷菌數。為了更好地模擬MTB的感染途徑，也有采用氣霧發(fā)生器通過(guò)呼吸道感染。霧化感染實(shí)驗的最適條件為5ml霧化液（細菌＋生理鹽水）霧化90分鐘，霧化吸入MTB數以106CFU為最佳，小鼠可出現明顯的結核肉芽腫病變，部分呈現壞死性改變。

大鼠：大鼠因具有價(jià)格低廉、抵抗力強、血標本容易采集等優(yōu)點(diǎn)，比小鼠更適宜實(shí)驗中多次采血。常用的大鼠品系有Sprague Dawley大鼠、Wistar大鼠等。以H37Rv毒株為例，大鼠肺臟感染以尾靜脈接種107CFU為宜，肝臟感染以尾靜脈接種108CFU為宜；脾臟感染以尾靜脈接種107CFU為宜，如采用腹腔接種則需活菌數達到108CFU。與小鼠類(lèi)似，大鼠模型同樣不能模擬人的肺部病理改變，不出現常見(jiàn)于人的干酪樣壞死、纖維化、鈣化以及空洞。

豚鼠：豚鼠被廣泛應用于MTB感染研究，結核病理改變與人體相似，尤以結核肉芽腫結構典型，細菌含量較低，可發(fā)展為壞死，是目前國際公認的TB模型最適動(dòng)物。豚鼠感染途徑多采用腹腔注射、腹股溝或大腿內側皮下注射、前肢皮下靜脈注射等途徑，但以氣溶膠吸入感染方式最能模擬MTB自然感染過(guò)程。豚鼠腹股溝或大腿內側皮下注射使用H37Rv菌量為0.3ml（含濕菌重0.3mg)。與其他MTB敏感動(dòng)物相比，豚鼠未建立近交系，并缺乏進(jìn)行免疫學(xué)分析的試劑，使其應用受到較大限制。低劑量不同的MTB毒株氣溶膠感染豚鼠，發(fā)現Erdman   K01、CSU93/CDC1551和HN878系MTB毒株和實(shí)驗室常用H37Rv毒株相比，豚鼠的存活時(shí)間更短。感染30天后，MTB逐漸從肺部彌散到支氣管周淋巴結、胰周淋巴結、脾、肝、胰、腎上腺和心臟。

非人靈長(cháng)類(lèi)：模擬人TB的最理想模型就是非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物模型。這類(lèi)模型對MTB通過(guò)自然途徑感染相當敏感，可發(fā)展為與人相似的疾病，包括臨床表現、組織病理變化等方面。同時(shí)，此類(lèi)模型能夠誘發(fā)抗原特異性T細胞反應，可被卡介苗(BCG)疫苗保護。最常用的非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物模型是短尾猴和獼猴。短尾猴用BCG免疫后幾乎可以完全抵抗MTB感染引起的病理?yè)p傷，與未免疫動(dòng)物相比大大減少肺組織中的荷菌盤(pán)。相反，獼猴用BCG免疫后，可發(fā)生嚴重的肺組織病理?yè)p傷，形成空洞、干酪樣壞死，與未免疫動(dòng)物相比肺中的病灶幾乎不減。與人相似，只有少數動(dòng)物會(huì )發(fā)病，大多數進(jìn)入潛伏感染狀態(tài)。如用高菌量(1× 104~1×105 CFU) 的H37Rv經(jīng)氣管內感染食蟹猴，可制備急性高致死率的多肺葉TB模型。用中等菌量(1×103CFU)接種動(dòng)物可制備成有臨床癥狀、慢性活動(dòng)、肉眼可見(jiàn)肺病灶、腦膜炎癥狀的TB模型。與小鼠和豚鼠感染模型相比，非人靈長(cháng)類(lèi)的感染模型更適合目前的研究。

【造模特點(diǎn)】：

急性感染發(fā)病快、病程短、病情重，具有較高的死亡率。MTB急性感染模型通常是采用大劑量MTB攻擊造成動(dòng)物機體組織的滲出壞死或增生。根據機體的免疫反應和變態(tài)反應性、菌量、毒力及組織特性的不同，出現不同的干酪樣壞死及滲出為主的病理變化。這些病理變化發(fā)生和發(fā)展較快，如未采用轉歸措施，將直接導致動(dòng)物的死亡。

【模型評估和應用】：

國內對MTB感染動(dòng)物造模成功的評判指標尚無(wú)統一之標準。多數以靶器官組織勻漿培養為主要認定方法，輔之以組織病理觀(guān)察和臟器重量指數測定，間或使用結核菌素試驗及組織標本抗酸染色等方法。

1.靶器官組織勻漿培養 頸椎脫臼法處死動(dòng)物，無(wú)菌分離脾臟、肺臟等靶器官。將組織利用200目濾網(wǎng)研磨過(guò)濾。取l00µl懸液稀釋至所需濃度梯度，分別從各梯度中取100µl接種到培養基，置37°C培養箱，3～4周后計菌落數。

2.病理組織觀(guān)察 病理切片如觀(guān)察到較多的結核結節或干酪樣壞死及液化灶等典型結核病變可作為造模成功的直接認定方法。但大多數嚙齒類(lèi)動(dòng)物均缺乏典型病理改變，故常須結合細菌學(xué)抗酸染色加以確定。因此，組織病理陽(yáng)性加上抗酸染色陽(yáng)性成為最客觀(guān)、最直接的成功模型確定方法。

3.臟器重量指數測定 動(dòng)物主要臟器重量及臟器指數是藥物慢性實(shí)驗檢測的項目，根據臟器重量計算臟器指數可以判斷內臟器官病變的性質(zhì)和程度。當某臟器受結核分枝桿菌H37Rv感染后，該臟器便會(huì )增大增重，用臟器的重量與動(dòng)物體重的值表示感染臟器的病變程度，即臟器重量指數，該指數愈大，則表示病變程度愈重。計算方法：臟器重量指數＝臟器重量（g)/體重(g)×100%。實(shí)驗動(dòng)物臟器重量臟器指數是動(dòng)物實(shí)驗中常用的重要基礎數據，也是MTB感染模型判別的最常用指標。

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