前言

經(jīng)典誘發(fā)性帕金森病動(dòng)物模型，多采用利血平、6-OHDA、MPTP誘導嚙齒類(lèi)和靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物法。

部分造模方法

使用動(dòng)物：大鼠

【造模機制】：

1. 利血平是一種生物復合物，可以通過(guò)封閉囊內不可逆的單胺的運輸，消耗中樞和外周的單胺，導致肌肉僵硬，姿勢彎曲，運動(dòng)減慢或無(wú)能，從而出現了與帕金森病相似的臨床癥狀。

2. 6-OHDA和DA的結構相似。在動(dòng)物機體內，6-OHDA被轉送至兒茶酚胺類(lèi)神經(jīng)通路吸收系統，6-OHDA代謝導致眾多氧化應激現象，由于自由基的形成最終使得DA神經(jīng)元抗過(guò)氧化系統破壞，隨著(zhù)自由基對線(xiàn)粒體功能的損傷，其膜穩定性和DNA完整性的破壞，最終致使細胞死亡。在注射6-OHDA的30分鐘內即可觀(guān)察到6-OHDA對DA神經(jīng)元毒害作用，注射14~26天90％以上DA細胞丟失。將不同劑量的6-OHDA定位注射于大鼠的黑質(zhì)周?chē)秃谫|(zhì)紋狀體通路上均能夠選擇性損毀黑質(zhì)內DA神經(jīng)元，可模擬出自發(fā)性帕金森病的原始病理過(guò)程，最終產(chǎn)生類(lèi)似自發(fā)性帕金森病。

3. 黑質(zhì)選擇性毒物MPTP，本身不具有神經(jīng)毒性，但可以穿越血－腦脊液屏障，并主要在星形膠質(zhì)細胞和5-HT能神經(jīng)元內的單胺氧化酶B作用后轉變?yōu)橛卸拘缘?－甲基－4苯基吡啶離子(MPP+), 然后釋放到細胞外，MPP+不能穿越血－腦脊液屏障，而是經(jīng)由DA轉運體進(jìn)入DA能神經(jīng)末梢和胞體。MPP+對DA細胞的選擇性毒性源于它被選擇 性攝入神經(jīng)元，一旦進(jìn)入DA神經(jīng)元末梢，MPP+被逆行轉運至黑質(zhì)，從而通過(guò)干預線(xiàn)粒體，引起脂質(zhì)過(guò)氧化，使得膜結構紊亂，影響細胞功能，最終導致選擇性破壞黑質(zhì)DA能神經(jīng)元，導致黑質(zhì)DA能神經(jīng)元大量死亡，紋狀體酪氨酸羥化酶陽(yáng)性纖維大量喪失，紋狀體DA及其代謝產(chǎn)物3,4-二羥基苯乙酸、高香草酸水平均明顯降低，也有黑質(zhì)紋狀體小膠質(zhì)細胞和星形細胞的增生和藍斑、下丘腦等區的損傷，與帕金森病患者的改變基本相同。

【造模方法】：

1. Wistar大鼠，體重200~220g,10周，腹腔內注射一定劑量的利血平后可使其出現骨骼肌僵硬、震顫、身體屈曲、運動(dòng)減少及其他的一些類(lèi)似的帕金森病臨床主要運動(dòng)癥狀。

2. 6-OHDA損傷大鼠帕金森病模型，6-OHDA定向性注射通常定位千中間前腦束，而不是黑質(zhì)致密區，因為前者包含了所有傳出于黑質(zhì)致密層和前側蓋區的DA能神經(jīng)束。因此，與注射于黑質(zhì)致密區相比，當6-OHDA注射在中間前腦束時(shí)，DA細胞丟失更多，而且6-OHDA在中間前腦束導致?lián)p傷的病理變化與觀(guān)察到的自發(fā)性帕金森病有極強的相關(guān)性。常用的6-OHDA損傷的大鼠帕金森病模型是6-OHDA單側損傷大鼠帕金森病模型。它是用6-OHDA單側注射大鼠中腦黑質(zhì)誘發(fā)的單側中腦黑質(zhì)DA神經(jīng)元損毀模型。

立體定向毀損具體過(guò)程如下，將經(jīng)反復行為檢測確認無(wú)旋轉行為的大鼠進(jìn)行實(shí)驗。采用間隔注射兩點(diǎn)法制模：腹腔注射10％水合氯醛(40mg/kg) 將大鼠麻醉后，固定于Stoelting腦立體定向儀上（使雙側耳桿尖端插入外耳道，可聽(tīng)到“咔嚓＂聲，并使頭部?jì)蓚缺３衷谒轿恢?；門(mén)齒勾低于耳桿平面2.4mm，使前、后囟水平高度相差0.4mm以下）。常規消毒后，切開(kāi)頭皮約1.0cm，剝離骨膜，確定右側黑質(zhì)致密部和中腦腹側被蓋坐標，用針尖標記。牙科鉆小心鉆透顱骨（注意勿損傷硬腦膜），按確定坐標將微抵注射器連接于微最推進(jìn)器上，垂直入顱，緩慢進(jìn)針到預定深度，向黑質(zhì)致密區和中腦腹側被蓋區各注射6-OHDA 8µg（溶于4µl含質(zhì)量分數為0.2％抗壞血酸的生理鹽水中），注射深度應以針孔斜面中點(diǎn)為參照點(diǎn)，針尖向前，保證6-OHDA能準確注入預定部位，注射速度為1μl/min，留針10分鐘，緩慢退針(1mm/min)。牙科膠覆蓋鉆孔，常規縫合傷口，連續腹腔注射青霉素5萬(wàn)U一周以防止感染。

3. 大鼠對MPTP不敏感，不易誘發(fā)與帕金森病臨床相似的動(dòng)物模型，雖然小鼠相對敏感，但在30mg/(kg·d)劑量5~10天的作用下，黑質(zhì)A10區、藍斑、背核及下丘腦的神經(jīng)元仍不受任何影響。制作MPTP非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型常采用非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物全身靜脈、淺靜脈、頸總靜脈或腹腔注射MPTP方法進(jìn)行。選用成年非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物，注射MPTP (0.2~0.5mg/kg)，每天1次，共15~18天，也有報道僅用4~6天（劑量大小不同、年齡選擇差異、注射部位和途徑不同造成的差別），所有動(dòng)物均能出現帕金森病樣癥狀，與人體產(chǎn)生的癥狀相似。

【模型特點(diǎn)】：

1. 運用利血平誘發(fā)的大鼠帕金森病模型對快速評價(jià)治療帕金森病的藥物具有重要的價(jià)值。該模型迅速易得，但其癥狀會(huì )產(chǎn)生可逆性變化，該模型的缺點(diǎn)是不能深入復制自發(fā)性帕金森病的病理過(guò)程。因此，不能用于慢性DA消耗時(shí)產(chǎn)生的一些臨術(shù)變化的研究。該模型的另一缺陷在于，它與自發(fā)性帕金森病相比，當5-HT、去甲腎上腺素降到一個(gè)很低的水平時(shí)，可能導致兩者產(chǎn)生不同的藥理學(xué)反應。另外，通過(guò)注射酪氨酸類(lèi)似物（1－甲基酪氨酸），可抑制DA和去甲腎上腺素的合成，對嚙齒類(lèi)動(dòng)物具有與利血平誘導相似的功效，因此可選擇此方法復制帕金森病模型。

2. 由于同側紋狀體DA功能的喪失，動(dòng)物表現出向與6-OHDA引起的損傷部位相反側自發(fā)旋轉，暗示神經(jīng)節向丘腦和中腦運動(dòng)區發(fā)出的沖動(dòng)減少，該模型對于了解黑質(zhì)紋狀體通路降解時(shí)病理、電生理和藥理學(xué)變化非常有用，有利于我們對帕金森病癥狀產(chǎn)生機制的理解。假設在帕金森病中這種沖動(dòng)屬于過(guò)量運動(dòng)，那么這種行為所代表著(zhù)的就是抗帕金森病的作用。盡管6-OHDA單側損傷復制的大鼠帕金森病模型與帕金森病患者在病理學(xué)、藥理學(xué)的變化相似，但是這種動(dòng)物模型仍存在一些缺點(diǎn)。由于在這個(gè)模型中6-OHDA的損傷屬單側，通過(guò)大腦非損傷側補償介導的通路，可以影響大腦的單側作用DA消耗的改變。6-OHDA制備的大鼠模型需要立體定向儀等特殊設備，制作技術(shù)要求高，但大鼠易控制，來(lái)源廣，價(jià)格低，行為持續時(shí)間長(cháng)且觀(guān)察方便，因而是常用的模型之一。

3. MPTP誘導的嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型所表現的癥狀和病理變化與人帕金森病臨床主要體征相去甚遠。目前看來(lái)沒(méi)有太大的推廣價(jià)值。MPTP制備的非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型方法簡(jiǎn)單，行為體征、病理特征與人類(lèi)更相似，加之非人靈長(cháng)類(lèi)進(jìn)化上的類(lèi)人性、觀(guān)察和取材的易操作性，而廣泛受到人們的歡迎。此模型明顯優(yōu)于6-OHDA模型，是目前應用最廣泛的模型。

【模型的評估和應用】：

1. 應用利血平模型迅速發(fā)現了L-DOPA可作為治療帕金森病的潛在藥物。到目前為止，這種藥物依然是臨床治療帕金森病的首選藥物和主要藥物。

2. 6-OHDA單側損傷復制的大鼠帕金森病模型，可從模型動(dòng)物旋轉數量和方向上加以評估。由于動(dòng)物行為特異性差異，判斷大鼠帕金森病模型是否成功，通常以動(dòng)物出現旋轉行為的次數為標準，一般超過(guò)7轉／min即為成功的帕金森病模型，否則為不成功模型。6-OHDA損傷動(dòng)物引起的旋轉被認為是抗帕金森病的行為，但諸如震顫、強直和運動(dòng)減慢等帕金森病的主要臨床癥狀卻沒(méi)在這些動(dòng)物中出現。通過(guò)雙側注射6-OHDA在嚙齒類(lèi)動(dòng)物中間前腦束引起損傷的辦法也可誘導出帕金森 病癥狀，但是一些不利的癥狀包括吞咽困難、高致死率等使得這些帕金森病模型無(wú)法廣泛應用，因而不常用。當直接向紋狀體注射6-OHDA時(shí)，一些動(dòng)物紋狀體DA中樞端通路發(fā)生部分耗竭，在這種帕金森病模型中，紋狀體神經(jīng)元退化速率非常緩慢。與中間前腦束注射6-OHDA相比，向紋狀體注射6-OHDA時(shí)，黑質(zhì)紋狀體神經(jīng)元退化的速度與自發(fā)性帕金森病極其相似。但是，經(jīng)紋狀體注射6-OHDA引起部分損傷，紋狀體中DA耗竭不足可以引起異常運動(dòng)。因此，當評估治療帕金森病能力時(shí)，不能使用向紋狀體注射6-OHDA復制的帕金森病動(dòng)物模型。

3. 非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物是人類(lèi)進(jìn)化過(guò)程的近親，在神經(jīng)系統的發(fā)生發(fā)育學(xué)上表現出與人類(lèi)密切的相關(guān)和相似性，且其行為與人類(lèi)行為的可比性，都提示著(zhù)研究者對它們的關(guān)注。MPTP意外發(fā)現和在非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物體的使用，使帕金森病動(dòng)物模型的各方面研究有了長(cháng)足的進(jìn)步。MPTP損傷后，非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物會(huì )顯示姿勢異常、運動(dòng)減少、四肢緊張彎曲、肢體強直伴有震顫、吞咽困難、不能進(jìn)食、發(fā)音減弱、定向反應性減弱等體征。動(dòng)物反應的程度與MPTP劑量及動(dòng)物年齡有關(guān)，給予L-DOPA后所有癥狀減輕。

前面提及的對放線(xiàn)菌素等一類(lèi)細菌、真菌和植物可合成產(chǎn)生的蛋白質(zhì)酵解抑制劑在大鼠的研究結果，同樣在非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型的研制中引起關(guān)注。美國Machel Jackson Foundation、英國Motac Neuroscience、法國B(niǎo)asal Gang等跨國研究機構和組織均已在這方面的研究中有所投入。使PSI導致非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病的研究成為該病非人靈長(cháng)類(lèi)動(dòng)物模型制作的新熱點(diǎn)話(huà)題。李秦等和Motac Neuroscience開(kāi)展合作研究，已經(jīng)開(kāi)始并且階段性地完成了部分研究工作，研究發(fā)現該方法制造的非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型具有較高優(yōu)越性：①造模制劑毒性溫和，沒(méi)有廣泛的急性毒副作用，不會(huì )引起動(dòng)物癱瘓和死亡，大大降低造模風(fēng)險；②造模過(guò)程相對緩和，在動(dòng)物機體不出現劇烈體征波動(dòng)的情況下，即可完成模型的制作，更加近似于人類(lèi)原發(fā)性帕金森病的病理過(guò)程；③在腦內形成的病變更類(lèi)似于人類(lèi)，尤其是黑質(zhì)中DA神經(jīng)元的缺失的PET檢驗更加能夠表明其模型相似性；④動(dòng)物模型的行為表現與MPTP損傷穩定后的模型無(wú)明顯差異。對于在黑質(zhì)DA神經(jīng)元中是否可見(jiàn)Lewy樣包涵體，還要進(jìn)一步觀(guān)察。

綜上所述，由于帕金森病發(fā)病機制并不是很明確，現有模型和自發(fā)帕金森病不具有完全相同病因學(xué)，但一定有相似性。已有的幾種非人靈長(cháng)類(lèi)和嚙齒類(lèi)動(dòng)物模型都是通過(guò)對腦部施加實(shí)驗因素完成的，這些模型都不會(huì )出現與原發(fā)性帕金森病完全相同的病理生理改變和神經(jīng)分化模式，特別是在疾病進(jìn)行性變化方面更不能很好體現。在目前還沒(méi)有更好的造模方法的情況下，可以說(shuō)，MPTP誘導的非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型是目前較為成熟、有價(jià)值的帕金森病研究載體，MPTP制備的非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型，方法簡(jiǎn)便，行為和病理方面的變化與人相近。PSI誘導的非人靈長(cháng)類(lèi)怕金森病模型不但涵蓋了MPTP制備的非人靈長(cháng)類(lèi)帕金森病模型的所有優(yōu)點(diǎn)，而且在疾病發(fā)生上更加與人類(lèi)原發(fā)性帕金森病相似，是環(huán)境毒素致病學(xué)說(shuō)的有力佐證，有廣闊開(kāi)發(fā)和應用前景。

類(lèi)似于人的帕金森病臨床繼發(fā)癥，利用MPTP誘導獼猴出現帕金森病主要體征之后，機體也會(huì )出現很多病理、生理、代謝功能上的變化，這些綜合因素共同作用的結果就會(huì )使動(dòng)物出現各種各樣的臨床癥狀。隨著(zhù)帕金森病三大主要體征：運動(dòng)減慢、震顫和強直的出現和加劇，動(dòng)物的食欲和采食能力也不斷下降，若不及時(shí)采取相應的對策和有效的處理方法，動(dòng)物的體質(zhì)將迅速降低，出現消化不良、便秘、消瘦、肌肉萎縮等與營(yíng)養有關(guān)的其他體征，進(jìn)一步發(fā)展，動(dòng)物的免疫功能也逐漸低下，條件致病病原體感染隨之出現。這在已處于帕金森病主要體征狀態(tài)下的動(dòng)物就很有可能無(wú)法承受，致動(dòng)物救治無(wú)效于成模中途死亡，實(shí)驗失敗。因此，一套有效的繼發(fā)癥防治方案和一個(gè)良好的、全價(jià)的、易于帕金森病態(tài)下動(dòng)物消化吸收的營(yíng)養食物配方對保障大批量造模工作的順利進(jìn)行是非常重要的。很多研究人員在造模過(guò)程中會(huì )遇到此類(lèi)問(wèn)題，需要結合其具體情況對帕金森病模型動(dòng)物可能出現的各種并發(fā)癥有針對性進(jìn)行預防和處置，以保證模型動(dòng)物的長(cháng)期維持。

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