? ? ? ? ?病原微生物是指可以侵犯人體，引起感染甚至傳染病的微生物，或稱(chēng)病原體。病原體種類(lèi)非常多，包括病毒、細菌、真菌和其他微生物等。
在科研方面，微生物學(xué)檢測已經(jīng)成為分子生物學(xué)創(chuàng )立的支柱之一，基因工程、生物工程、遺傳生物學(xué)的創(chuàng )立與發(fā)展都離不開(kāi)微生物學(xué)的基礎；在臨床方面，基于病原學(xué)證據的抗感染治療也將病原微生物檢測視為金標準，對于改善患者病情與預后，預防和控制環(huán)境感染有著(zhù)重大的意義。
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微生物檢測技術(shù)縱覽
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我們獲得的樣本中，一般都會(huì )存在多種細菌，此時(shí)需要將樣本進(jìn)行分離培養，一般分為平板分離培養或血培養。
當平板培養或血培養出現陽(yáng)性結果時(shí)，需要進(jìn)行微生物鑒定。鑒定一般分為三個(gè)層次，其一為菌落形態(tài)鑒定，其二為染色鏡檢鑒定，其三為生化鑒定，三者聯(lián)合進(jìn)行結果判斷。而當陽(yáng)性樣本出現多菌種時(shí)，需要重新采樣進(jìn)行分離培養及純化培養。
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1 染色鏡檢
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病原微生物體形微小，大多無(wú)色半透明狀，若是肉眼觀(guān)察菌落形態(tài)還無(wú)法判斷的話(huà)可將其染色后可借助顯微鏡觀(guān)察其大小、形態(tài)、排列等，能夠對于形態(tài)特殊的病原體進(jìn)行直觀(guān)的檢查，不需要特殊的儀器和設備。
2 生化鑒定
? ? ? 生化方法檢測病原微生物實(shí)際上是測定微生物特異性酶。由于各種微生物所具有的酶系統不完全相同，對許多物質(zhì)的分解能力亦不一致。因此可利用不同底物產(chǎn)生的不同代謝產(chǎn)物來(lái)間接檢測該微生物內酶的有無(wú)，從而達到檢測特定微生物的目的。
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基因層面的檢測技術(shù)能夠改善傳統檢測過(guò)程中應用外部形態(tài)和生理特征進(jìn)行檢測的現狀，能夠采用特有的基因片段序列對病原微生物的種類(lèi)進(jìn)行鑒別，所以基因檢測技術(shù)以其自身獨到的優(yōu)勢被臨床醫學(xué)檢驗領(lǐng)域廣泛應用。
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1 聚合酶鏈反應(PCR)
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聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是一種在體外是用已知寡核苷酸引物引導未知片段中微量待測基因片段并進(jìn)行擴增的技術(shù)。由于PCR可以對待測基因進(jìn)行擴增，特別適用于病原體感染早期的診斷。PCR技術(shù)在近20年里發(fā)展迅速，從基因擴增到基因的克隆和改造以及遺傳分析，可靠性逐步提高。
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溫江醫學(xué)城·分子生物學(xué)實(shí)驗室 |
QuantStudio3?熒光實(shí)時(shí)定量分析系統 |
2 基于16S rRNA的檢測技術(shù)
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隨著(zhù)測序技術(shù)發(fā)展，DNA大規模測序得以進(jìn)行，現階段各種常見(jiàn)細菌的16S rRNA基因幾乎全部測序完成，它們相對穩定且有較高的拷貝數(每個(gè)細胞幾千個(gè)拷貝)，其序列中含可變區及高度保守區，因此可設計群、屬、種特異性的探針。
16S rRNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細菌基因分類(lèi)的靶序列，逐漸成為細菌鑒定、分類(lèi)的熱門(mén)檢測技術(shù)。16SrRNA檢測技術(shù)利用現有病原菌標準菌株制作DGGE(變性梯度凝膠電泳)標準marker，然后對疑似“病原菌”擴增16SrRNA進(jìn)行DGGE分析，這樣可以做到快速檢測。
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基因簇（KO）豐度熱圖 |
種水平的精細組成圖 ? |
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1 血清學(xué)檢測
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采用血清學(xué)檢測能夠對病原微生物進(jìn)行快速鑒定，血清學(xué)檢測技術(shù)的基本原理是通過(guò)已知的病原體抗原以及抗體對病原體進(jìn)行檢測，與傳統的細胞分離培養相比，血清學(xué)檢驗的操作步驟簡(jiǎn)單，其常用的檢測方法之一則為酶聯(lián)免疫測試技術(shù)等。酶聯(lián)免疫測試技術(shù)的應用能夠大幅度提高血清學(xué)檢測的敏感性和特殊性，不僅能夠對檢測樣本中的抗原進(jìn)行檢測，還能夠檢測抗體成分。
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酶聯(lián)免疫實(shí)驗室 |
全波長(cháng)酶標儀 |
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2 藥敏實(shí)驗
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傳統藥敏試驗一般分為紙片擴散法、稀釋法、快速藥敏 E-test三種方法，判定標準為最低抑菌濃度MIC值和抑菌圈直徑KB值。
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制片擴散法：
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紙片擴散法是將含有定量抗菌藥物的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上，紙片中的藥物在瓊脂中擴散，隨著(zhù)擴散距離的增加，抗菌藥物的濃度呈對數減少，從而在紙片的周?chē)纬蓾舛忍荻?。同時(shí)，紙片周?chē)志鷿舛确秶鷥鹊木瓴荒苌L(cháng)，而抑菌范圍外的菌株則可以生長(cháng)，從而在紙片的周?chē)纬赏该鞯囊志?，不同的抑菌藥物的抑菌圈直徑因受藥物在瓊脂中擴散速度的影響而可能不同，抑菌圈的大小可以反映測試菌對藥物的敏感程度，并與該藥物對測試菌的MIC呈負相關(guān)。
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稀釋法：
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稀釋法藥敏試驗可用于定量檢測待測細菌對待驗證抗菌藥物的抗藥性或敏感性，分為瓊脂稀釋法和肉湯稀釋法。實(shí)驗時(shí)，抗菌藥物的濃度通常經(jīng)過(guò)倍比稀釋?zhuān)芤种拼郎y菌肉眼可見(jiàn)生長(cháng)的最低藥物濃度成為最小抑菌濃度（MIC），一個(gè)特定抗菌藥物的測試濃度范圍應該包含能夠檢測細菌的解釋性折點(diǎn)（敏感、中介和耐藥）的濃度，同時(shí)也應該包含質(zhì)控參考菌株的MIC。
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抑菌實(shí)驗結果1-常量肉湯稀釋法
注：圖A直接觀(guān)察；圖B加TTC試劑染色觀(guān)察
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? ? ? 除此之外，免疫學(xué)技術(shù)、多重PCR技術(shù)、核酸雜交技術(shù)、基因芯片技術(shù)、環(huán)介導等溫擴增技術(shù)、鏈置換擴增技術(shù)、重組酶聚合酶擴增技術(shù)、宏基因組測序技術(shù)(mNGS)、靶向基因組測序技術(shù)(tNGS)、質(zhì)譜分析技術(shù)也被大量應用于微生物檢測中。隨著(zhù)人類(lèi)對于病原微生物的檢測手段的不斷升級，希望對于將來(lái)生命科學(xué)行業(yè)有著(zhù)新的啟示。
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