“RNA世界”假說(shuō)提出，地球上最早的生命可能是基于RNA的——一種單鏈分子，類(lèi)似于DNA，并且與某些現代病毒有相似之處。這是因為，像DNA一樣，RNA可以攜帶遺傳信息，但像蛋白質(zhì)一樣，它還可以作為催化劑，促進(jìn)或加速化學(xué)反應。雖然已有一些RNA催化劑（即核糖酶）的活性得到了驗證，但計算預測表明，成千上萬(wàn)種其他RNA催化劑可能存在于從細菌到植物、動(dòng)物等各類(lèi)生物體中。

最近發(fā)表于《Nucleic Acids Research》雜志上的研究中，賓夕法尼亞州大學(xué)的研究人員開(kāi)發(fā)出一種新方法，即高通量剪切檢測或CHiTA，其可以在一次實(shí)驗中測試這些預測的核糖酶的活性。

研究團隊測試了2600多種不同的RNA序列，這些序列被預測屬于一種叫作“Twister核糖酶”的類(lèi)別，這類(lèi)RNA酶能夠將自身剪切成兩部分。大約94%的核糖酶在實(shí)驗中表現出活性，研究還發(fā)現，這些核糖酶即便在結構上存在細微缺陷，仍能保持其功能。此外，研究團隊還首次在哺乳動(dòng)物的基因組中發(fā)現了一種Twister核糖酶，特別是在瓶鼻海豚的基因組中。

“DNA是雙鏈分子，通常形成簡(jiǎn)單的螺旋結構，而RNA是單鏈的，可以折疊成多種不同的結構，包括環(huán)狀、膨脹區和螺旋，”賓夕法尼亞州大學(xué)Eberly科學(xué)學(xué)院化學(xué)系、生物化學(xué)與分子生物學(xué)系的杰出教授、研究團隊負責人Phil Bevilacqua表示。“RNA催化劑的功能依賴(lài)于這些結構，它們被分為幾類(lèi)。我們選擇專(zhuān)注于所謂的‘Twister核糖酶’，因為它們的一項特征是能夠將自身剪切成兩部分，這一過(guò)程可以通過(guò)分析其基因序列觀(guān)察到。”

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圖片信息：賓夕法尼亞州立大學(xué)開(kāi)發(fā)的新型切割高通量測定 （CHiTA） 提供了一種無(wú)疤痕方法，可在單個(gè)實(shí)驗中表征數千種不同的小自裂解 RNA 酶，稱(chēng)為 twister 核酶。該圖顯示了一些經(jīng)過(guò)測試的核酶的 2D 模型，這些核酶的螺旋和環(huán)元件有缺陷，但仍然活躍，這表明 twister 核酶的自裂解能力可以容忍這些輕微的結構缺陷。

在這項研究之前，約有1600種Twister核糖酶根據基因組序列和結構預測被提出，但其中只有少數幾種經(jīng)過(guò)實(shí)驗驗證。他們還通過(guò)仔細手工搜索圍繞一個(gè)短的、高度保守的序列的基因組背景，還發(fā)現了大約1000種額外的Twister核糖酶候選序，該序列是 1,000 個(gè)生物體基因組中許多核酶所共有的。

CHiTA依賴(lài)于兩個(gè)關(guān)鍵技術(shù)。其一是近年來(lái)開(kāi)發(fā)的“平行大規模寡核苷酸合成”（MPOS）技術(shù)。這項技術(shù)使得研究團隊能夠設計并購買(mǎi)成千上萬(wàn)種不同的核糖酶序列，并將它們合成成小片段DNA，所有這些序列可以在同一個(gè)試管中進(jìn)行實(shí)驗。他們設計的每個(gè)序列都以其中一個(gè)2,600種預測的核糖酶序列為核心，再在兩端附加短DNA片段，幫助他們復制DNA并轉錄成RNA進(jìn)行活性測試。

圖片信息：研究摘要。

“通過(guò)MPOS，我們只需創(chuàng )建一個(gè)包含我們感興趣的序列的電子表格，發(fā)送給供應商，之后他們會(huì )把每種序列的小量樣本寄給我們，”研究的首位作者、賓夕法尼亞大學(xué)博士生Lauren McKinley解釋道。“對于CHiTA，我們需要大量的每種序列，因此我們會(huì )在每個(gè)序列的兩端添加DNA片段，以便通過(guò)PCR技術(shù)制作大量拷貝。但這些額外的DNA片段可能會(huì )影響我們測試核糖酶功能的準確性。”

CHiTA的第二個(gè)關(guān)鍵技術(shù)是通過(guò)“限制酶”蛋白來(lái)去除這些附加的DNA片段。限制酶能夠在特定的短序列（稱(chēng)為識別位點(diǎn)）處切割DNA。然而，大多數限制酶在識別位點(diǎn)的中間切割DNA，導致切割后的DNA片段仍帶有部分識別位點(diǎn)序列，這可能影響核糖酶的結構和功能。

“我們發(fā)現了一種限制酶，它能在識別位點(diǎn)附近稍遠的地方切割DNA，這樣就能確保設計的序列在切割后不會(huì )留下多余的DNA片段，”McKinley說(shuō)道。“這樣，我們就可以確保測試的正是核糖酶的精確序列。”

在實(shí)驗中，研究團隊首先通過(guò)MPOS訂購的序列進(jìn)行擴增，利用限制酶去除任何附加的DNA片段，然后將DNA轉錄成RNA。如果某個(gè)序列編碼的是活性核糖酶，當RNA合成后，它會(huì )迅速折疊成功能性結構并自我剪切。研究人員隨后可以收集RNA并將其轉化為cDNA（互補DNA），然后進(jìn)行測序，以確定RNA是否已被剪切，或者是否仍為完整序列。

“我們對cDNA進(jìn)行測序時(shí)，可以看到有多少RNA已經(jīng)被剪切，這作為核糖酶活性的一個(gè)標志，”McKinley解釋道。“在我們測試的序列中，約94%表現出明顯的RNA剪切。實(shí)際上，每個(gè)活性核糖酶的剪切比例與之前單獨測試的核糖酶結果相似。”

接著(zhù)，研究團隊檢查了這些測試序列的預測結構，發(fā)現其中許多序列與經(jīng)典的Twister核糖酶結構相比，存在一些輕微的變化或缺陷，但它們依然能夠自我剪切。這表明，核糖酶的功能對結構上的細微變化有較高的容忍度，即使結構不完美，它們依然能夠正常發(fā)揮作用。

這一結構容忍度提示，可能存在更多未被發(fā)現的Twister核糖酶，它們不符合最初搜索的標準。事實(shí)上，基于這項研究中新發(fā)現的序列描述，研究團隊在瓶鼻海豚的基因組中首次發(fā)現了哺乳動(dòng)物的Twister核糖酶。

“了解這些核糖酶在序列和結構上的容忍度將幫助我們設計新的、更有效的核糖酶識別方法，”Bevilacqua教授表示。“我們目前對核糖酶功能的了解大多依賴(lài)于化學(xué)原理，而它們在生物學(xué)中的作用仍然是我們正在探索的領(lǐng)域。能夠在像CHiTA這樣的大規模實(shí)驗中測試核糖酶的活性，將有助于加速我們發(fā)現新核糖酶的進(jìn)程，并更深入地理解它們在細胞中的作用。這也將幫助我們追溯早期地球生命的起源，探索RNA在生命起源中可能發(fā)揮的關(guān)鍵作用。”

雜志：Nucleic Acids Research

DOI：10.1093/nar/gkae908