你可能在新聞中看到過(guò)這則消息：一名患有罕見(jiàn)病的嬰兒通過(guò)個(gè)性化治療，成功修正了特定的基因突變。該療法是利用一種被稱(chēng)為“堿基編輯”的基因編輯技術(shù)開(kāi)發(fā)而成，這一方法由Alexis Komor 在哈佛大學(xué)擔任博士后期間開(kāi)發(fā)。

自2016年該研究發(fā)表以來(lái)，現任California大學(xué)San Diego分?；瘜W(xué)與生物化學(xué)的副教授Komor 一直在深入研究堿基編輯工具，以便更好地了解其功能并進(jìn)一步發(fā)展其能力。其最新研究成果最近發(fā)表于《Nature Communications》期刊，系統闡明了特定DNA修復蛋白如何通過(guò)促進(jìn)、抑制或改變編輯路徑來(lái)精確調控堿基編輯的結果。

基因組DNA由四種堿基組成——胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）、鳥(niǎo)嘌呤（G）和腺嘌呤（A）。這些堿基組合形成約30億個(gè)不同的堿基對，并以雙螺旋結構排列。

人類(lèi)基因組成具有99.9%的相似性，剩下的0.1%則是每個(gè)人之間的差異。在一個(gè)人攜帶C堿基的位點(diǎn)，另一個(gè)人可能對應T堿基。任意兩個(gè)人之間存在數百萬(wàn)種基因變異，盡管大多數變異是無(wú)害的，但有些可能導致嚴重遺傳問(wèn)題。

對于許多遺傳疾病的群體而言，基因編輯可能是唯一的解決方案。

傳統的基因編輯方法通常使用CRISPR-Cas9技術(shù)對DNA進(jìn)行物理性修改。向導RNA將Cas9蛋白引導至特定的DNA位置后，Cas9在那里會(huì )完全切斷DNA（即雙鏈斷裂）。細胞內存在多種可識別DNA損傷并通過(guò)修復通路實(shí)施修補的蛋白。

圖1：顯示胞嘧啶堿基編輯中間體的示意圖，特別標注了當 UNG 蛋白活躍時(shí)可能發(fā)生的各種結果。

通常，這些通路會(huì )把斷開(kāi)的DNA末端重新連接起來(lái)（即連接反應）。然而，隨著(zhù)斷裂和修復次數的增加，不必要的插入和缺失（indels）的發(fā)生率也隨之上升。當產(chǎn)生indels時(shí)，目標位點(diǎn)的基因序列即被破壞，導致編輯失敗或產(chǎn)生非預期突變。

Komor在博士后階段找到了一種通過(guò)避免雙鏈斷裂來(lái)實(shí)現更高效基因編輯的方法，從而降低indels發(fā)生率。她將這一新型工具稱(chēng)為“堿基編輯”，因為它能逐字地化學(xué)改變DNA堿基。

“通過(guò)堿基編輯，我們不僅可以實(shí)現更好的結果，其作用過(guò)程也更為完善，”Komor表示。“雙鏈斷裂可能是有害的，甚至導致細胞死亡，還可能引起大規模的基因組重組。而堿基編輯則避免了這種情況。”

圖 2：CRISPRi 篩選結果和驗證。

Komor開(kāi)發(fā)了兩種工具，一種是將A堿基轉換為G堿基的腺嘌呤堿基編輯器（ABE），另一種是將 C 堿基轉化為 T 堿基的胞嘧啶堿基編輯器 （CBE）。堿基編輯器通過(guò)中間體進(jìn)行轉換。以CBE為例，胞嘧啶首先被轉化為尿嘧啶，這是一種存在于RNA中的核酸。在修復過(guò)程中，DNA將尿嘧啶識別為胸腺嘧啶。

盡管沒(méi)有雙鏈斷裂，堿基編輯器仍會(huì )在一條鏈上造成切口。附著(zhù)于Cas9的酶通過(guò)化學(xué)方式改變堿基。CBE在理想條件下實(shí)現的編輯效率可以達到90-95%，但也存在其他非預期編輯結果（如C->G）。

堿基編輯器雖成效顯著(zhù)，其作用機制卻尚待闡明，特別是不同DNA修復蛋白如何影響最終編輯結果（C->T, C->G 或修復回C），仍有待深入闡明——這正是Komor團隊研究的核心目標。

一種特定的蛋白質(zhì)，尿嘧啶N-糖苷酶（UNG），能夠找到并去除尿嘧啶。該蛋白質(zhì)的存在會(huì )增加不良結果的發(fā)生率。當抑制UNG活性時(shí)，CBE的效率提高。然而Komor的團隊對其完整機制仍存認知空白。

圖3：MSH2、MSH6 和 UNG 敲低對 K562、HeLa 和 HEK293T 細胞中 C•G 至 T•A 結果的影響。

為了揭示真相，該團隊采用了一種叫作基因敲低的技術(shù)來(lái)降低基因的表達能力。他們對人類(lèi)基因組中全部2,015種DNA修復/處理蛋白進(jìn)行了這個(gè)實(shí)驗。

隨后，他們利用綠色熒光蛋白標記系統來(lái)分選和識別發(fā)生了特定編輯事件的細胞：一種是發(fā)生C->T編輯（期望結果）的細胞；另一種是發(fā)生由UNG活性驅動(dòng)的C->G編輯（用于研究該路徑）的細胞。

他們使用CRISPRi篩查進(jìn)行這項工作，該篩查通過(guò)向導RNA作用于目標基因并降低其表達。Komor的CRISPRi細胞有兩條引導RNA——一條用于激活帶有CBE的熒光蛋白標記，另一條針對具體的修復蛋白進(jìn)行敲低。最終，Komor團隊構建了包含約12,000種不同向導RNA組合的文庫用于CRISPRi篩選。

一旦收集到所有發(fā)光的細胞，團隊就對向導RNA進(jìn)行測序，以查看哪些基因被敲低（其表達對堿基編輯具有抑制作用）。

他們發(fā)現一種叫作Lig3的連接酶抑制了堿基編輯。連接酶的作用是將斷裂的DNA鏈的末端重新連接，而當Lig3存在時(shí)，CBE編輯的效率下降。

“我們認為L(cháng)ig3會(huì )悄悄地將那個(gè)切口封住。這樣，我們就沒(méi)有機會(huì )將尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶了。這就像Lig3在阻礙我們期望的編輯發(fā)生。”Komor解釋道。

團隊還發(fā)現錯配修復通路對胞嘧啶堿基編輯具有促進(jìn)作用。該通路中的MutS-α蛋白復合體（由兩種蛋白構成，在細胞生命周期持續表達）被敲降時(shí)，C到T編輯的效率顯著(zhù)下降。Komor推測MutS-α能識別尿嘧啶中間體并促進(jìn)其向胸腺嘧啶轉化。

既然工具有效，深究機理是否必要？Komor給出了肯定答案。

“這些堿基編輯工具已經(jīng)相當優(yōu)秀，但并不完美，”她說(shuō)。“如果我們能更好地理解它們在細胞內的機制，就能幫助我們提高效率，甚至開(kāi)發(fā)出新型的堿基編輯器。”

Komor同時(shí)強調，了解這些工具的工作原理對安全性至關(guān)重要。堿基編輯是否會(huì )激活意想不到的細胞反應？是否會(huì )造成DNA損傷或細胞死亡？我們對堿基編輯器的機制及細胞的反應了解得越多，就越能觀(guān)察和防范意外后果。

“這也是國家科學(xué)基金會(huì )支持這項工作的原因之一?；A科學(xué)研究旨在解析事物本質(zhì)及其在特定環(huán)境中的運作規律”，Komor說(shuō)。

基礎科學(xué)研究的實(shí)際影響往往需要數十年才能顯現，但Komor的堿基編輯技術(shù)在更短時(shí)間內便開(kāi)始在相關(guān)領(lǐng)域得到應用。她指出，迄今為止，全球至少有10名患者受益于基于CBE技術(shù)的個(gè)性化治療。此外，多個(gè)相關(guān)研究正在進(jìn)行，預計未來(lái)這一數字將大幅增加。

期刊：Nature Communications

DOI：10.1038/s41467-025-59948-z